三、操作技術(shù)的影響

操作過(guò)程的控制：

1. 嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。操作前將試劑在室溫下平衡30～60min。

2. 加樣后及時(shí)放人孵箱。標(biāo)本較多時(shí)，要分批操作。按說(shuō)明步驟嚴(yán)格控制操作時(shí)間，防止孵育時(shí)間人為延長(zhǎng)，導(dǎo)致非特異性結(jié)合緊附于反應(yīng)孔周圍，難以清洗che底。

3. 封板溫育時(shí)，各孔一定要封嚴(yán)，防止陽(yáng)性標(biāo)本的液體蒸發(fā)，產(chǎn)生周邊現(xiàn)象從而導(dǎo)致“花板"的出現(xiàn)。

4. 用洗板機(jī)洗板時(shí)，保證洗液注滿各孔，洗板針暢通，洗完板后在吸水紙(選擇干凈、無(wú)或少塵的吸水材料)上輕輕拍干：還要防止針口有纖維蛋白或異物，這些異物在洗板的過(guò)程中易產(chǎn)生拖帶現(xiàn)象而導(dǎo)致“花板"的出現(xiàn)。

5. 合理安排檢測(cè)量，以免反應(yīng)板過(guò)多造成洗板等待時(shí)間長(zhǎng)。

6. 加酶試劑后用吸水紙?jiān)诿笜?biāo)板表面輕拭吸干。

7. 顯色劑盡量在臨用前配制，堅(jiān)持不用過(guò)期顯色劑，肉眼可見(jiàn)淺藍(lán)色的TMB顯色劑不用。

8. 加樣時(shí)保持顯色劑不外流;A、B液應(yīng)避免接觸金屬器械。加終止液時(shí)應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。

9. 應(yīng)保證C清潔，整個(gè)操作過(guò)程中保證酶標(biāo)板不接觸次氯酸。以上的措施可以使“花板"降至zui低限度。從而提高檢測(cè)的特異性。并得到更準(zhǔn)確、可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

   加樣吸嘴的潔凈與否和吸量的準(zhǔn)確性，直接影響檢測(cè)結(jié)果。由于吸嘴構(gòu)造特殊，導(dǎo)致清洗困難，加大了交叉污染的機(jī)會(huì)。建議用一次性吸嘴。加樣器也要經(jīng)常清洗，定期校準(zhǔn)。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在 ELISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出。

   溫浴影響，在建立 ELISA 方法作反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究時(shí)，實(shí)驗(yàn)表明，兩次抗原 抗體 反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1-2 小時(shí)，產(chǎn)物的生成可達(dá)ding峰。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，反應(yīng)板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。應(yīng)注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。由于公司的 試劑 盒溫育是在空氣浴中完成，采用水浴會(huì)造成值偏高或花板。

   另外溫育中還有邊緣效應(yīng)，邊上的值會(huì)偏高，建議為了客觀的判斷結(jié)果，將質(zhì)控放在非邊緣位置。96孔酶標(biāo)板結(jié)構(gòu)特別;易產(chǎn)生邊緣效應(yīng)，抗原抗體結(jié)合及酶促反應(yīng)對(duì)溫度有嚴(yán)格要求，酶標(biāo)板周圍與內(nèi)部孔升降溫速率不同，造成周邊與內(nèi)部孔結(jié)果差異;干浴與水浴存在明顯的差異，盡可能使用水浴，并要求固相板放入水中，減少受熱不均，貼密封膜，防止污物浸入。

   洗滌在 ELISA 過(guò)程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。ELSIA 就是靠洗滌來(lái)達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過(guò)洗滌以清除殘留在板孔中沒(méi)能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過(guò)程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來(lái)?？梢哉f(shuō)在ELISA 操作中，洗滌是zui主要的關(guān)鍵技術(shù)，應(yīng)引起操作者的高度重視，操作者應(yīng)嚴(yán)格按要求洗滌，不得馬虎。

   洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液，各種 試劑 盒的洗液不要混用。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團(tuán)，也含親水基團(tuán)，其疏水基團(tuán)與蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)借疏水鍵結(jié)合，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合，并借助于親水基團(tuán)和水分子的結(jié)合作用，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時(shí)，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗(yàn)的靈敏度。

   洗液需要稀釋，應(yīng)按要求稀釋。配制洗液應(yīng)用新鮮的和高質(zhì)量的純化水，電導(dǎo)率小于1.5μs/cm，洗液如果結(jié)晶應(yīng)待其融解后配制。手洗條件一致性較差，對(duì)結(jié)果影響較大，防止洗液在孔內(nèi)形成氣泡。半自動(dòng)與全自動(dòng)冼板機(jī)使用不當(dāng)也會(huì)影響結(jié)果，血清中殘留的的纖維蛋白絲或洗滌液析出的結(jié)晶易使洗板機(jī)針小孔全阻塞或半阻塞狀態(tài)，造成未結(jié)合標(biāo)記酶洗脫不che底，導(dǎo)致“花板"造成假陽(yáng)性或假陰性;所以操作洗板機(jī)過(guò)程中要不時(shí)觀察洗板機(jī)針孔內(nèi)洗液的通暢狀況，及時(shí)糾正，洗板機(jī)不用時(shí)應(yīng)用去離子水清冼幾遍。